FWF - Engineering methyltransferases - Änderung der Kofaktorspezifität von Methyltransferasen

  • Tengg, Martin (Teilnehmer (Co-Investigator))

Projekt: Forschungsprojekt

Projektdetails

Beschreibung

Die Übertragung von Methylgruppen ist ein essentieller Schritt, der in vielen Reaktionen jeder lebenden Zelle stattfindet. Diese Transformation wird von Methyltransferasen (MTasen) katalysiert. Alle MTasen benötigen Kofaktoren um ihre Funktion ausüben zu können, wobei S-Adenosyl-L-Methionin der am Häufigsten verwendete Kofaktor in biologischen Systemen ist. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass neben dem natürlichen SAM auch SAM-Analoga mit erweiterten Kohlenstoffketten, von DNA-C-MTasen sowie auch von C-MTasen die kleine Moleküle methylieren, als Kofaktoren akzeptiert werden. Dieser Antrag beschreibt die Kombination von gerichteter Evolution und rationalem Enzymdesign von C-MTasen mit dem Ziel einer verbesserten Übertragung von erweiterten Kohlenstoffketten von SAM-Analoga. Dabei ist es sehr schwierig geeignete Selektionsverfahren für MTasen zu entwickeln. Der erste Teil dieses Antrags beschreibt die gerichtete Evolution der DNA MTase M.SssI auf SAM-Analoga. Dafür soll die Methode der in vitro Kompartimentierung (IVC) verwendet werden, bei welcher eine Genbank in kleine Wasser in Öl Emulstionströpfchen verpackt wird in denen die in vitro Expression der Genvarianten abläuft. Zur Selektion positiver Klone macht man sich die Tatsache zu Nutze, dass DNA-Methylierung vor der Fragmentierung durch kognate Restriktionsenzyme schützt. Somit stellt diese Methodik eine Verbindung zwischen Genotyp und Phänotyp her und ermöglicht eine effektive Selektion von evolvierten Enzymvarianten. Die Ergebnisse der M.SssI Evolution sollen dann für ein rationales Enzymdesign von NovO (methyliert kleine Moleküle) verwendet werden. Aufgrund der großen strukturellen Ähnlichkeiten beider Enzyme in Bezug auf ihren Faltungstyp, welcher auch die Kofaktorbindestelle enthält, ist eine Kombination von Zufallsmutagenese mit anschließender gerichteter Evolution von M.SssI und rationalem Design von NovO, sinnvoll. Neben der Analyse von Enzymaktivitäten sollen auch biophysikalische Methoden zur Aufklärung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen angewendet werden. Die Bestimmung der Dissoziationskonstanten von MTasen und Kofaktoren wird die Bedeutung einzelner Mutationen bezüglich der Kofaktor Spezifität hervorheben. Zusammenfassend sollen die Ergebnisse dieses Projektes zu einer weiteren Aufklärung und möglichen Anwendung von enzymatischen Alkylübertragungen führen.
StatusAbgeschlossen
Tatsächlicher Beginn/ -es Ende1/10/1410/07/15

Fingerprint

Erkunden Sie die Forschungsthemen, die von diesem Projekt angesprochen werden. Diese Bezeichnungen werden den ihnen zugrunde liegenden Bewilligungen/Fördermitteln entsprechend generiert. Zusammen bilden sie einen einzigartigen Fingerprint.