FWF - Pichia Organellen - Characterization of organelles from the yeast Pichia pastoris

Die methylotrophe Hefe Pichia pastoris wird weltweit als effizientes System für die heterologe Expression von Proteinen genutzt. Neben dieser biotechnologischen Anwendung wurde diese Hefe in zunehmendem Maße für Studien der Proteinsekretion und der Biogenese von Peroxisomen herangezogen, deren Proliferation durch Wachstum auf Methanol oder Fettsäuren stark induziert wird. Obwohl große Fortschritte in Biochemie und Molekularbiologie von Pichia pastoris erzielt wurden, ist überraschend wenig über deren Zellbiologie bekannt. So existieren derzeit kaum analytische Daten über Pichia pastoris Organellen. Aus diesem Grund wird im vorliegenden Projekt ein systematisches Programm zur Isolierung, Analyse und Charakterisierung der wichtigsten Organellen dieses Mikroorganismus vorgeschlagen, wobei besonderes Augenmerk auf Proteine und Lipide der Organellenmembranen gelegt wird. Methoden zur Isolierung der Peroxisomen, Mitochondrien, Lipidpartikel, Vakuolen, Plasmamembran, des Endoplasmatischen Reticulums, Golgi und des Cytosols sollen basierend auf der Expertise unseres Labors auf dem Gebiet der Zellfraktionierung von Saccharomyces cerevisiae entwickelt bzw. adaptiert werden. Zur Charakterisierung von Pichia pastoris Organellen, d.h. zur Bestimmung des Anreicherungsund Kontaminationsgrades, sollen Antikörper gegen spezifische Pichia pastoris Organellen-Marker generiert und verwendet werden. Hochgereinigte Organellenfraktionen werden zur Analyse der Proteine und Lipide herangezogen, wobei Standard-Methoden unseres Labors zur Anwendung kommen. Die grundlegende Charakterisierung der Organellen soll auf die Analyse des Proteoms der wichtigsten subzellulären Faktionen mit Hilfe von Massenspektrometrie erweitert werden. Die Lipidanalyse umfasst die Quantifizierung von Phospholipiden, Neutrallipiden, Sterolen, Fettsäuren und Sphingolipiden. Außerdem soll eine Kollektion Organellen spezifischer Marker-Proteine gekoppelt an Green Fluorescent Protein (GFP) hergestellt und zur Sichtbarmachung der einzelnen Organellen, deren Struktur und Entwicklungsstadien verwendet werden. Weitere Untersuchungen zur Zellstruktur werden mit Hilfe der Elektronenmikroskopie in Zusammenarbeit mit Prof. Hofer, FELMI, Graz, durchgeführt. Zusammenfassend soll eine detaillierte Einsicht in die Organellen von Pichia pastoris ermöglicht werden, was wiederum eine wichtige Voraussetzung zur Verbesserung der Proteinexpression auf der Organellen-Ebene darstellt. Langfristig besteht der Plan, durch Manipulation der Pichia pastoris Organellen und Membranen die Bildung und Ausbeute von heterologen Proteinen, insbesondere von membrangebundenen Polypeptiden, zu verbessern.