FWF - Enzymatischer Zellulaseabbau - In situ Visualisierung des enzymatischen Zelluloseabbaus

Die enzymatische Hydrolyse von Zellulose ist ein Schlüsselfaktor bei der Produktion von Biotreibstoffen der zweiten Generation, die ein etabliertes Gebiet im Feld der erneuerbaren Energien sind. Trotz einer Fülle an verfügbaren Informationen über Struktur und Funktion der Zellulasen ist der komplizierte Mechanismus mit dem sie ihr komplexes Substrat zerlegen - was der Kern des Problems ist - noch immer nicht bekannt. Das zentrale Ziel in der Entwicklung von Biotreibstoffen ist daher die Überwindung dieser "Widerspenstigkeit" des Substrates. Um die strukturelle Dynamik des enzymatischen Zelluloseabbaus zu untersuchen, nützen wir das Vorhandensein eines unlöslichen Substrates aus: die in situ Visualisierung des enzymatischen Abbaus mittels Rasterkraftmikroskopie (atomic force microscopy, AFM) ist in diesem Fall die Methode der Wahl. AFM weist nicht nur die nötige Auflösung auf, um sogar Einzelenzyme zu beobachten, man kann auch den Effekt, den viele Enzyme auf dem Substrat bewirken, beobachten. Außerdem kann man den enzymatischen Zelluloseabbau beobachten ohne Substrat oder Enzyme zu zerstören und man kann auch unter Flüssigkeit messen [mit Hilfe einer sogenannten Flüssigzelle (liquid cell)]. In einer Vorstudie haben wir die strukturelle Dynamik eines Cellulasekomplettsystems aus Trichoderma reesei auf einer nano-flachen Zellulosepräparation untersucht. Dabei haben wir beobachtet, dass zunächst längliche Fissuren entstehen die sich mit fortschreitendem Substratabbau zu tiefen, konischen Rissen entwickeln. Die Dynamik dieser Oberflächenrisse spiegelt das Zusammenspiel des Abbaus der Substratoberfläche in den Rissen sowie außerhalb dieser wider und es ist gut vorstellbar wie erschwerte Diffusion zu Produktinhibierung und Verlust an kooperativer Interaktion der Enzyme untereinander führt, was die Aktivität der Cellulasen in einem wachsenden Riss zeitweise vermindert. In dem hier vorgeschlagenen Projekt möchten wir den Mechanismus einzelner Cellulasen mit Hilfe von in situ Visualisierung mit AFM aufklären: wie interagieren Cellobiohydrolase I und II und Endoglucanasen mit ihrem Substrat und wie bauen sie es ab? Neben diesen Nicht-komplexierten Systemen werden wir auch den Zelluloseabbau durch bakterielle Cellulosome aus Clostridium thermocellum untersuchen. Weiters interessieren wir uns für die Interaktionen der Zellulosebindedomäne mit dem Substrat. Diese Studie ist durch eine enge Kooperation unseres Labors mit dem Institut für Elektronenmikroscopie (FELMI-ZfE) an der TU Graz möglich. Wir erwarten, dass wir in diesem Projekt grundlegende Fragen klären können: wie verläuft der enzymatische Zelluloseabbau auf einer strukturellen Ebene? Was sind die Rollen der verschiedenen Exo- und Endoenzyme? Welche sind die limitierenden / verlangsamenden Faktoren in der Zellulosehydrolyse und wie können sie überwunden werden? Welcherart ist der Einfluss von Substrateigenschaften (Kristallinität, Mikrostrukturen, sich ändernde Oberfläche, etc.) auf die Cellulaseaktivität? Wie verändert sich ddas Substrat während der Hydrolyse? Dieses Projekt wird wichtige Einblicke in die strukturelle Dynamik der Zelluloseverzuckerung geben. Auf Basis der Ergebnisse können neue Strategien, um die Biotreibstoffproduktion aus Lignozellulose wirtschaftlich zu machen, entwickelt werden.